引言

随着生物学、材料学、解剖学等现代技术地不断发展，金属、合金、陶瓷、高分子、复合材料开始用于人体骨组织修复。其中，由钙磷组成的生物陶瓷材料已用于人体接近四十年。钙、磷元素是人骨组织的主要无机成分。由于与人体骨组织的无机成分具有相似的组成和结构，磷酸钙生物陶瓷具有良好的生物相容性，生物活性，对人体无毒、无害，与人体细胞膜表层多糖和蛋白质以氢键结合，并且能牢固地结合于骨组织。磷酸钙生物陶瓷主要包括羟基磷灰石和磷酸三钙陶瓷两种。羟基磷灰石已被广泛用于人体骨组织修复，但长期临床观察结果发现羟基磷灰石陶瓷难降解，而磷酸三钙虽然可以降解，但是降解速率无法控制；由二者组成的复相陶瓷材料的降解性能主要依赖于磷酸三钙相含量的多少，但其降解程度仍然不佳。

实验

1、样品制备

将磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2·H2O)与碳酸钙(CaCO3)粉末，按照钙磷摩尔比1∶1(样品A)，1.5∶1(样品B)，1.65∶1(样品C)进行混合，将磷酸氢钙(CaHPO4)与硫酸钙(CaSO4·2H2O)按钙磷摩尔比1.67∶1(样品D)和1.5∶1(样品E)进行混合，用乙醇做分散剂。在60℃烘箱中烘干后，加去离子水适量并压制成6mm×5mm的圆柱形颗粒。将样品放入马弗炉中，在℃条件下烧结5h，随炉冷却，得到生物陶瓷。

2、降解实验

准确称量样品的初始重量记录为W0，将样品与磷酸缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)按照1g/30mL的比例置入密闭的聚乙烯管中，在(37±0.5)℃恒温振荡器(PHS-3C，上海世义精密仪器有限公司)中震荡，震荡速率为50r/min。每周更换一次PBS溶液。将样品A，C，D降解前与降解2周后材料烘干表面喷金，用扫描电子显微镜(SEM，HitachiS-Japan)观察表面形貌的变化。

3、细胞毒性实验

按照GB/T.5-标准要求，制备样品D浸提液，采用同浓度的L成纤维细胞和新鲜的DMEM细胞培养基作为空白对照组。细胞毒性的实验测试时间点为2,4和6d。对浸提液接触法所培养的L细胞采用倒置相差光学显微镜观察其形态，细胞形态的改变、溶解与数量的增减。

结果与讨论

1、XRD分析

样品A，B，C烧结前的XRD如下图所示。图中样品A、B、C中均为磷酸二氢钙与碳酸钙的峰，未发现其他物质的峰，表明磷酸二氢钙与碳酸钙混合后并未发生化学反应。

样品A、样品B和样品C烧结前，与Ca(H2PO4)2、CaCO3的XRD图谱

样品D,E烧结前的XRD如下图所示。

CaHPO4、CaSO4和样品D,E烧结前的XRD图谱

在样品D，E中均能看到磷酸氢钙与硫酸钙的峰，未发现其他物质的峰，表明磷酸氢钙与硫酸钙混合后也未发生化学反应。

烧结后的样品A，B，C，D，E的XRD结果如下图所示。可见，样品A中的峰为磷酸三钙的特征峰(2θ=27.8，31.1，34.0°)，表明烧结后的产物为磷酸三钙陶瓷。

样品A、样品B、样品C和样品D和样品E烧结后的XRD图谱

2、钙磷比

烧结后的样品A，B，C，D，E通过草酸盐分离-ED-TA容量法与磷钼酸喹啉重量法分别滴定样品中的钙、磷含量，计算得到其钙磷比分别为1.54，2.12，2.3，1.66和1.49。其中样品A，B，C与烧结之前的钙磷比发生了较为明显的变化。其原因是样品A，B，C在烧结过程中生成P2O5，发生了升华反应。样品A最终的生成产物为磷酸三钙，所以钙磷比接近1.5。

3、降解实验

为了考察陶瓷材料的降解性能，将样品A，B，C，D，E浸泡在PBS中，考察其失重率变化，其结果如下图所示。

样品A、样品B、样品C、样品D、样品E在PBS中浸泡28d的失重率图

28d后样品A，B，C，D，E分别降解了4%，17%，19%，34%，35%。样品A由于生成磷酸三钙难溶于水，所以在降解7d后，失重率仅为4%。样品B，C在降解14d后，降解速率明显变缓，可能是由于样品中的氧化钙及其他杂质在前期溶解完全后，样品中的羟基磷灰石与磷酸三钙不溶于水的原因。样品D，E的失重率高于样品A，B，C，其原因是焦磷酸钙与硫酸钙的溶解性大于磷酸三钙与羟基磷灰石。

虽然5个样品都在28d时达到pH值接近中性，但样品B，C在第一周时pH值呈强碱性，最高达到了13.3，是因为在烧结过程中碳酸钙分解生成氧化钙，遇水后生成氢氧化钙所致。可见，在磷酸二氢钙与碳酸钙混合烧结过程中，当钙过量时生成氧化钙，且氧化钙含量会随着钙含量的增加而增加，在降解过程中使溶液呈碱性;当磷酸氢钙与硫酸钙混合烧结时，随着钙含量的增加，生成的焦磷酸钙与硫酸钙双相陶瓷的降解速率下降。

4、细胞形态

选取样品D进行细胞毒性实验，观察其在2，4，6d的细胞形态，如下图所示((b)，(d)，(f))。可以看出，与样品D浸提液共同培养的活细胞呈现圆形或者梭形，其细胞数目和含量随时间的延长而增多，细胞间隙减少。说明样品D不影响细胞增殖，无细胞毒性。同时，由于样品D随时间降解，浸提液中含大量析出的离子，细胞增殖的速度较空白组((a)，(c)，(e))较慢。

L在样品D的浸提液中2，4，6d与空白对照组的光镜图

结论

将磷酸二氢钙与碳酸钙;磷酸氢钙与硫酸钙按照不同钙磷比通过混合烧结，当磷酸二氢钙与碳酸钙钙磷比为1∶1时生成磷酸三钙陶瓷;其钙磷比为1.5∶1与1.65∶1时生成磷酸三钙与羟基磷灰石双相陶瓷;磷酸氢钙与硫酸钙钙磷比为1.67与1.5时焦磷酸钙与硫酸钙双相陶瓷。通过28d降解实验得到，焦磷酸钙与硫酸钙双相陶瓷可持续降解，且对浸泡液pH值无显著影响，无细胞毒性，因此，该双相陶瓷可望用于人体骨组织修复。